Molecular Epidemiology, Genotyping and Antimicrobial Susceptibility Studies on Brucella spp. Isolated from Livestock

Brucellosis is a notifiable zoonotic disease of public health importance affecting animals and humans globally. Although the disease is controlled and eradicated from the developed world, it is still an endemic and often neglected zoonosis in developing countries including Egypt. The disease is emerging and remains endemic at high prevalences in ruminants particularly at established intensive breeding farms. The disease is also continuously introduced by the import of animals especially camels from neighboring brucellosis endemic countries like Sudan. Serological surveillance programs in the country have given indirect proof of brucellosis in cattle, buffaloes, sheep, goats, camels, equines, dogs, cats, and pigs. Published scientific literature has highlighted the dominance of B. melitensis bv3 and B. abortus bv1 infecting animals and humans in the country. The disease can be transmitted to other animals via direct or indirect contact. Clinically healthy animals may be a carrier of infection and a source of disease spread. Humans get infected via the consumption of unpasteurized milk and milk products and contact with infected animals. Movement of infected animals can also spread the infection to atypical hosts that become carriers. Although brucellosis is endemic in Egypt, reports were scarce regarding its epidemiology in pigs. Thus, seroepidemiological surveillance was performed in pigs using serological and molecular assays. To achieve this objective, 331 serum samples were collected from two governorates (Cairo and Giza) having pig production. Samples were analyzed using competitive and indirect Brucella ELISAs. Anti-Brucella antibodies were detected in 4.83% and 10.8% pig sera by i-ELISA and c-ELISA, respectively. Molecular assays identified Brucella DNA in 3.02% of tested serum samples and identified as B. melitensis (7/10) and B. suis (3/10). The identification of both, B. melitensis and B. suis DNA, in serum samples of pigs was never reported till now. The results of this study provide help to develop effective control strategies for animal and human brucellosis in Egypt (Chapter 2). The transmission of host-specific Brucella spp. to non-preferred hosts may occur due to the mixed rearing of farm animals. Data regarding Brucella spp. in the camel population in Egypt are scarce. Thus, this thesis focused on the seroepidemiology of camel brucellosis in three governorates (Giza, Aswan, and Al-Bahr Al-Ahmar (The Red Sea)) with the highest camel population and the largest camel markets in Egypt to determine the seroprevalence and to identify the Brucella spp. of local camel holdings. Serologic assays conducted on 381 serum samples of camels showed that anti-Brucella antibodies were detected in 59 (15.5%), 87 (22.8%), 77 (20.2%) and 118 (31.0%) of sera by RBPT, i-ELISA, c-ELISA and CFT, respectively. Using real-time PCR, Brucella DNA was amplified from 32 (8.4%) seropositive samples and DNA of all species supposingly prevalent in Egypt was found: Brucella abortus (25/32), Brucella suis (5/32) and Brucella melitensis (2/32). Identification of B. suis DNA in camel sera reflects the complex epidemiological situation of brucellosis in Egypt. A high prevalence of brucellosis was observed in male animals. No significant association of brucellosis was found with age, sex, breed, and regions. The role of open markets in crossspecies transmission and dissemination of brucellae nationwide and regionally is highlighted (Chapter 3). The complex epidemiological situation of brucellosis in livestock poses risk to public health also. In this study, 29 B. abortus and B. melitensis strains were isolated from lymph nodes, milk, and fetal abomasal contents of infected cattle, buffaloes, sheep, and goats from nine districts. The phenotypic and genotypic patterns of antimicrobial resistance in local Brucella isolates were investigated. Notably, massive phenotypic resistance was observed in B. melitensis strains against ciprofloxacin, erythromycin, imipenem, rifampicin, and streptomycin, 76.2%, 19.0%, 76.2%, 66.7%, and 4.8%, respectively. Whereas, 25.0%, 87.5%, 25.0%, and 37.5% of B. abortus strains were resistant to ciprofloxacin, erythromycin, imipenem, and rifampicin, respectively. Molecular analysis identified mutations in the rpoB gene associated with rifampicin resistance. These mutations were identified in all phenotypically resistant isolates. Mutations in gyrA and gyrB genes associated with ciprofloxacin resistance were also identified in B. melitensis. Repeated mutations were detected at positions 676, 677 (TAC to CTC/tyrosine to leucine) and 1435 (AAG to CAG/lysine to glutamine) in the rpoB gene of phenotypic resistant B. melitensis isolates while the same was recorded at position 2890 (CGT to GGT/arginine to glycine) in the rpoB gene for B. abortus isolates. Similarly, mutations in the gyrA gene were detected at positions 167 (ATG to AGG/methionine to arginine), 197 (CCC to CGC/proline to arginine), 202 (CGC to AGC/arginine to serine), 235 (GGT to CGT/glycine to arginine), 941 (GCC to GAC/alanine to aspartic acid), 944 (GTG to GAG/valine to glutamic acid), 944-945 (GTG to GGA/valine to glycine), 946 (GCC to TCC/alanine to serine) and 962 (AAC to ACC/asparagine to threonine) in B. melitensis strains. Mutations detected in genes associated with antimicrobial resistance unravel the molecular mechanisms of resistance in Brucella isolates from Egypt. The mutations in the rpoB gene in phenotypically resistant B. abortus isolates in this study were reported for the first time for Egypt. The results of this study advocate for more research on the epidemiology and spread of antimicrobial resistance in Brucella strains (Chapter 4). Several studies from Egypt highlight the endemicity of brucellosis in the country. However, there are limited data available on the genetic diversity of brucellae circulating in Egypt. In this study, WGS was used to discriminate the genotypes along with virulence-associated factors and genetic markers responsible for antimicrobial resistance in 29 Brucella isolates (21 B. melitensis and 8 B. abortus) recovered from livestock in Egypt. In silico classical MLST identified sequence type-11 and sequence type-1 of B. melitensis and B. abortus strains, respectively in animal species in Egypt. These sequence types (ST-11 and ST-1) share a close relationship with Mediterranean and Asian, American, or European lineages respectively. In silico MLVA-16 analysis divided B. abortus and B. melitensis strains into 2 and 10 distinct genotypes, respectively. These strains types circulate in different governorates. However, cgSNPs analysis provided higher resolution and discriminated B. abortus and B. melitensis strains into 3 and 14 genotypes. Additionally, SNP variants were identified in rpoB and gyrA genes responsible for antimicrobial resistance in brucellae against rifampin and ciprofloxacin, respectively. These mutations are present at position 297-GAT to GAA/Asp-Glu in gyrA and two-point mutations were found in the rpoB gene at position 2784 (CGC to CGT/Arg-Arg) and 2394 (ACG to ACT/Thr-Thr) in 3 and 4 strains of B. melitensis, respectively (Chapter 5). Studien zur molekularen Epidemiologie, Genotypisierung und Antibiotikaresistenz an Brucellaisolaten von landwirtschaftlichen Nutztieren Brucellose ist eine anzeigepflichtige weltweit auftretende Zoonose, die in vielen Ländern von großer Bedeutung für den öffentlichen Gesundheitssektor ist. Die Krankheit ist Bekämpfungs- und Überwachungsprogramme in vielen Industrieländern nur noch von geringer Bedeutung. In vielen Entwicklungsländern, einschließlich Ägypten, ist sie immer noch endemisch und wird in ihrer Bedeutung oft vernachlässigt. Deshalb ist die Brucellose insbesondere in den etablierten Zuchtbetrieben weit verbreitet. Die Krankheit wird außerdem kontinuierlich durch die Einfuhr von Tieren, vor allem von Kamelen, aus brucellose-endemischen Nachbarländern wie dem Sudan importiert. Bei serologische Überwachungsuntersuchungen in Ägypten wurde Brucellose bei Rindern, Büffeln, Schafen, Ziegen, Kamelen, Pferden, Hunden, Katzen und Schweinen nachgewiesen. In der wissenschaftlichen Literatur dominieren dabei B. melitensis bv3 und B. abortus bv1 bei Tieren und Menschen. Die Infektion wird zwischen den Tieren durch direkten oder indirekten Kontakt übertragen. Auch Tiere ohne Krankheitssymptome können als Infektionsquelle fungieren. Der Mensch infiziert sich meist durch den Verzehr von unpasteurisierter Milch und Milchprodukten sowie durch den Kontakt mit infizierten Tieren. Obwohl die Brucellose in Ägypten endemisch ist, gab es kaum Berichte über die Situation bei Schweinen. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit seroepidemiologische Untersuchungen bei Schweinen mittels immunologischer und molekularer Assays durchgeführt. Dafür wurden 331 Serumproben aus zwei Gouvernoraten (Kairo und Gizeh) mit hohen Schweinebeständen entnommen und mittels kompetitivem und indirektem Brucella-ELISA analysiert. Anti-Brucella-Antikörper wurden in 16 (4,83%) und 36 (10,8%) Schweineseren mittels i-ELISA bzw. c-ELISA nachgewiesen. Molekulare Assays identifizierten Brucella-DNA in 3,02% (10) der untersuchten Serumproben. Über die Identifizierung sowohl von B. melitensis-DNA (7/10) als auch von B. suis-DNA (3/10) in Schweineserumproben wurde bisher noch nie berichtet. Die Ergebnisse dieser Studie tragen dazu bei, wirksame Bekämpfungsstrategien für Brucellose in Ägypten zu entwickeln (Kapitel 2). Die Übertragung von Brucella spp. von bevorzugten auf nicht bevorzugte Wirte kann aufgrund der gemischten Aufzucht von Nutztieren auftreten. Über Brucella spp. in der Kamelpopulation in Ägypten liegen nur wenige Daten vor. Diese Arbeit ist auf Untersuchung der Kamelbrucellose in drei Gouvernoraten (Gizeh, Assuan und Al-Bahr Al-Ahmar (Rotes Meer)) mit der höchsten Kamelpopulation und den größten Kamelmärkten in Ägypten fokusiert, um hier die Seroprävalenz zu bestimmen und Brucella spp.-DNA in Kamelbeständen zu identifizieren. Serologische Untersuchungen an 381 Seren von Kamelen zeigen, dass bei 59 (15,5%), 87 (22,8%), 77 (20,2%) und 118 (31,0%) der Proben Anti-Brucella-Antikörper durch RBPT, i-ELISA, c-ELISA bzw. KBR nachgewiesen wurden. Mittels Real-time-PCR wurde Brucella-DNA in 32 (8,4%) seropositiven Proben amplifiziert, darunter Brucella abortus (25/32), Brucella suis (5/32) und Brucella melitensis (2/32). Es wurde eine hohe Prävalenz von Brucellose bei männlichen Tieren im Vergleich zu weiblichen Tieren beobachtet. Es konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Brucellose und dem Alter, dem Geschlecht, der Rasse und den Regionen nachgewiesen werden. Das Vorkommen von B. melitensis-, B. suis- und B. abortus-Infektionen bei Kamelen weist auf eine komplexe epidemiologische Situation der Kamelbrucellose in Ägypten hin. Dies kann vermutlich auch auf die Rolle wenig kontrollierter Märkte bei der artübergreifenden Übertragung und Verbreitung von Brucellosen auf nationaler und regionaler Ebene (Kapitel 3). Die weite Verbreitung von Brucellose bei Nutztieren in Ägypten, stellt auch ein Risiko für die öffentliche Gesundheit dar. In dieser Studie wurden 29 B. abortus- und B. melitensis-Stämme aus Lymphknoten, Milch und fetalen Labmageninhalten von infizierten Rindern, Büffeln, Schafen und Ziegen aus neun Distrikten in Ägypten isoliert. Diese Isolate wurden hinsichtlich ihrer phänotypischen und genotypischen antimikrobiellen Resistenzeigenschaften untersucht. Dabei wurde Resistenzen bei B. melitensis gegen Ciprofloxacin (76,2%), Erythromycin (19,0%), Imipenem (76,2%), Rifampicin (66,7%) und Streptomycin (4,8%) festgestellt. Bei B. abortus waren jeweils 25,0%, 87,5%, 25,0% und 37,5% der Isolate resistent gegen Ciprofloxacin, Erythromycin, Imipenem und Rifampicin. Durch die Genotypisierung wurden Mutationen im rpoB-Gen, die mit der Rifampicin-Resistenz assoziiert sind, in allen phänotypisch resistenten Isolaten identifiziert. Mutationen in den gyrA- und gyrB-Genen, die mit Ciprofloxacin-Resistenz assoziiert sind, wurden auch bei B. melitensis gefunden. Wiederholte Mutationen wurden an den Positionen 676, 677 (TAC zu CTC/Tyrosin zu Leucin) und 1435 (AAG zu CAG/Lysin zu Glutamin) im rpoB-Gen von phänotypisch resistenten B. melitensis-Isolaten nachgewiesen, während Mutationen an Position 2890 (CGT zu GGT/Arginin zu Glycin) im rpoB-Gen von B. abortus-Isolaten festgestellt wurde. In ähnlicher Weise wurden Mutationen im gyrA-Gen an den Positionen 167 (ATG zu AGG/Methionin zu Arginin), 197 (CCC zu CGC/Prolin zu Arginin), 202 (CGC zu AGC/Arginin zu Serin), 235 (GGT zu CGT/Glycin zu Arginin), 941 (GCC zu GAC/Alanin zu Asparaginsäure), 944 (GTG zu GAG/Valin zu Glutaminsäure), 944-945 (GTG zu GGA/Valin zu Glycin), 946 (GCC zu TCC/Alanin zu Serin) und 962 (AAC zu ACC/Asparagin zu Threonin) in B. melitensis nachgewiesen. Mutationen, die in Genen entdeckt wurden, die mit antimikrobieller Resistenz assoziiert sind, entschlüsseln die molekularen Mechanismen der Resistenz in Brucella-Isolaten aus Ägypten. Über die Mutationen im rpoB-Gen in phänotypisch resistenten B. abortus-Isolaten wurde in dieser Studie zum ersten Mal in Ägypten berichtet. Die Ergebnisse dieser Studie geben einen Einblick in die Epidemiologie und Verbreitung antimikrobiell resistenter Brucella-Stämme im Land (Kapitel 4). Es gibt nur wenige Daten über die genetische Vielfalt der in Ägypten zirkulierenden Brucellen. Mittels Gesamtgenomsequenzierung wurden 29 ägyptische Brucella-Isolate (21 B. melitensis und 8 B. abortus) genotypisiert und virulenzassoziierte Faktoren und Marker bestimmt, die für die antimikrobielle Resistenz verantwortlich sind. Mittels in-silico MLST wurden die bei Nutztieren in Ägypten vorherrschenden Sequenztypen-11 und -1 von B. melitensis und B. abortus gefunden. Diese Sequenztypen sind auch bei anderen mediterranen, asiatischen, amerikanischen und europäischen Linien gefunden worden. Die in-silico MLVA-16-Analyse ergab 2 B. abortus- und 10 B. melitensis-Genotypen, die in verschiedenen Gouvernoraten zirkulieren. Die cgSNP-Analyse lieferte eine höhere Auflösung und diskriminierte B. abortusund B. melitensis-Stämme in 3 bzw. 14 Genotypen. Zusätzlich wurden SNP-Varianten in den rpoB- und gyrA-Genen identifiziert, die für die antimikrobielle Resistenz von Brucellen gegen Rifampin bzw. Ciprofloxacin verantwortlich sind. Diese Mutationen betreffen bei 3 B. melitensis Stämmen die Position 297-GAT zu GAA/Asp-Glu in gyrA. Zwei-Punkt-Mutationen im rpoB-Gen an Position 2784 (CGC zu CGT/Arg-Arg) und 2394 (ACG zu ACT/Thr-Thr) wurden 4 Stämmen von B. melitensis nachgewiesen (Kapitel 5).